做液相色譜的同學(xué)都知道，液相色譜分離條件中，最重要的參數(shù)就是洗脫條件，其中分離條件又分為等度洗脫和梯度洗脫。

等度洗脫

是指在樣品組分的分析周期中，流動相的組成比例和流速恒定不變的洗脫方式。

梯度洗脫

是指在同一個分析周期中，按一定程度不斷改變流動相的濃度配比的洗脫方式。

在色譜分析時，等度洗脫和梯度洗脫各有優(yōu)勢和劣勢。

優(yōu)點

?對于等度洗脫而言，由于方法運行時，流動相的比例不發(fā)生變化，所以它對儀器的要求不高，只需要一個單元泵就可以運行方法。

?其次，由于等度洗脫條件單一，所以比較容易用來摸索方法設(shè)置，例如改變流動相比例，改變柱溫等條件。

?并且由于等度洗脫每次運行時的流動相比例相同，所以相同方法運行多個樣品時，樣品之間不需要設(shè)置平衡時間來讓系統(tǒng)恢復(fù)到所需的流動相比例。

缺點

?但是它也有缺點，那就是越往后出峰的組分色譜峰越寬。

?并且大多數(shù)等度洗脫的方法分析時間較長。

等度洗脫

優(yōu)點

?而梯度洗脫能夠規(guī)避掉等度洗脫的問題，例如梯度洗脫的樣品峰，無論先出峰還是后出峰的組分，它們的峰形基本都能保證尖銳對稱。

?其次由于梯度洗脫通常設(shè)置的流動相比例是讓洗脫強度越來越強，這樣能保證在較短的時間內(nèi)，讓樣品中強保留組分也能被洗脫出來。

缺點

?但是伴隨著這些優(yōu)點也會有對應(yīng)的缺點，首先它對儀器的配置要求較高，通常需要配置四元泵或者二元泵。

?其次它在每次運行樣品之間，需要設(shè)置一定的平衡時間，來讓系統(tǒng)中流動相的比例到達初始流動相比例。

?最后，由于它的方法設(shè)置復(fù)雜，例如影響分離的有初始流動相比例、流動相的梯度變化、結(jié)束流動相比例、柱溫箱溫度等，所以方法的開發(fā)和優(yōu)化會較為復(fù)雜。

梯度洗脫

了解了這么多等度洗脫和梯度洗脫的優(yōu)缺點，很多同學(xué)可能會有疑問，我如何知道我的樣品適合等度洗脫還是梯度洗脫呢？

不用著急，這是有規(guī)律可循的。

對于常規(guī)樣品而言，建議大家在初始設(shè)置方法時可以先參考以下初始條件運行：

20分鐘內(nèi)，將有機相比例從5-10%線性升高至100%，并保持一段時間以保證所有組分被洗脫出來。

如果在梯度結(jié)束后，有組分的洗脫時間超過梯度時間的25%，也就是該條件中如果有化合物在25分鐘之后被洗脫出來，則需要考慮更換保留能力更弱的色譜柱或更換極性更強的有機溶劑。

我們可以看出 ΔtG>0.25 tG，所以該方法不適合等度洗脫。
適合等度洗脫的方法要求 ΔtG<0.25tG。

 

如果你的方法適合等度洗脫，那么又該如何設(shè)置呢？

tr(avg)=(ti+tf)/2=17min

Δ%B/min=(%Bfinal-%Binitial)/tG=(100-5)/20=4.75 %B/min

等度洗脫流動相比例=(Δ%B/min x tr(avg))+%Binitial=(4.75x17)+ 5=85.75≈86%B

綜上所述，如果該樣品可以用等度洗脫，那么方法設(shè)置為：水相與有機相比例為14：86，保持17min。

 

梯度洗脫如何設(shè)置

如果該樣品需要做梯度洗脫，方法參數(shù)又該如何設(shè)置呢？

梯度洗脫主要包括以下幾個參數(shù)：初始流動相比例、結(jié)束流動相比例和流動相變化速率，同樣以之前的樣品為例：

Δ%B/min=(%Bfinal-%Binitial)/tG=(100-5)/20=4.75 %B/min

調(diào)整后的初始流動相比例

Optimized%Binitial

=(%Binitial+(tixΔ%B/min))-(V/FxΔ%B/min)-10%B

=(5+(12.786x4.75))-(5.5/2x4.75)-10

=42.67%B

調(diào)整后的結(jié)束流動相比例

Optimized%Bfinal

=(%Binitial+(tfxΔ%B/min))-(V/FxΔ%B/min)-10%B

=(5+(21.142x4.75))-(5.5/2x4.75)-10

=82.36%B

通過計算得到調(diào)整后的初始流動相比例等于42.67%，調(diào)整后的結(jié)束流動相比例等于82.36%。